一、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意的問(wèn)題

①蛋白樣品的提取及蛋白含量的檢測(cè)

 蛋白樣品的提取咱們*是按照試劑盒說(shuō)明書來(lái)做的，步驟沒(méi)有什么講的，但是因?yàn)榈鞍讟悠返暮脡闹苯記Q定了是否能做出來(lái)蛋白條帶，這就好比蓋房子所需要的磚頭一樣，一定要?jiǎng)?wù)必認(rèn)真。

②儀器準(zhǔn)備

 清洗玻璃板：玻璃板的正確拿法應(yīng)該是拿住玻璃板的左右兩側(cè)不要用手拿上下兩端，避免手套上面的臟東西順著水流流到玻璃板上，玻璃板請(qǐng)一定務(wù)必清洗干凈，不干凈的玻璃板上面的殘留物可能會(huì)影響凝膠之間的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致膠出現(xiàn)問(wèn)題，對(duì)后面的結(jié)果影響很大。

 玻璃板放置：玻璃板底部對(duì)齊，垂直放入夾子中間加緊，高的在后，矮的在前。

3凝膠配置

 根據(jù)蛋白分子量的大小選擇合適濃度的分離膠，可參考凝膠配置試劑盒中說(shuō)明書或者參考別人的文獻(xiàn)。配膠的APS需要在4度冰箱保存。注意配膠的時(shí)候膠一定一定要混勻，配膠的試劑中APS與TEMED是促凝劑，所以在加促凝劑之前先把其他組分混勻，可用*吹打也可用手腕去甩，向左甩n次再向右甩n次，或者用咱們實(shí)驗(yàn)室的混勻的那個(gè)儀器混勻，名字我給忘了，那個(gè)效果好產(chǎn)生的氣泡很少而且節(jié)省人力。。。

④將配置好的分離膠沿著玻璃板一側(cè)緩慢打入玻璃板中，這個(gè)時(shí)候不用擔(dān)心打入氣泡，灌入合適量的分離膠之后，加入適當(dāng)劑量的ddWater或者異丙醇封膠（加入封膠試劑量沒(méi)有規(guī)定，蓋住整個(gè)分離膠膠面即可）

5上樣

A. marker孔加入5微升，其余蛋白孔上樣10微升左右，不要加的太多，這個(gè)后面會(huì)做說(shuō)明。

B. 電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀請(qǐng)務(wù)必確定正負(fù)極是否對(duì)準(zhǔn)確，不要犯低級(jí)錯(cuò)誤。

⑥電泳

 這個(gè)沒(méi)有具體的時(shí)間限制，只要分子量小的蛋白跑到膠的底部即可。在電泳過(guò)程中是否需要進(jìn)行壓膠還是直接恒壓跑到底這個(gè)問(wèn)題后面說(shuō)明。電泳開始的時(shí)候開制冰機(jī)制冰，為后面的轉(zhuǎn)膜做準(zhǔn)備。

⑦轉(zhuǎn)膜

A. 電泳快結(jié)束的時(shí)候就可以配置轉(zhuǎn)膜液（轉(zhuǎn)膜液室溫20-30度不宜放過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，幾天內(nèi)用可以室溫放置，如果時(shí)間太長(zhǎng)可放入4度冰箱保存）

B. 根據(jù)自己的蛋白位置選擇合適的位置切膠，切膠過(guò)程中保持膠的濕潤(rùn)（用蒸餾水不定時(shí)潤(rùn)濕），因?yàn)槟z一旦干了脆性增強(qiáng)，很容易斷。

C. 根據(jù)膠的大小選擇合適大小的膜，膜和膠相同大小或者略小于膠，并且膠面和膜之間不能有氣泡，大多數(shù)人認(rèn)為如果膜大于膠會(huì)使得轉(zhuǎn)膜過(guò)程中膠面短路，一是使得局部的蛋白不能轉(zhuǎn)到膜上去，二是短路會(huì)使得局部溫度過(guò)高（熱量=U2/R*t）凝膠受熱變形，轉(zhuǎn)到膜上的蛋白歪七扭八，但是丁香園里面有大神說(shuō)過(guò)氣泡對(duì)于轉(zhuǎn)膜影響不大，我沒(méi)試驗(yàn)過(guò)。。

D. 膠，膜，濾紙，海綿放置成三明治結(jié)構(gòu)，一旦放好不要亂動(dòng)，否則對(duì)齊的膠和膜之間位置會(huì)有偏移。

A. 選擇合適的轉(zhuǎn)膜時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，至于轉(zhuǎn)膜是選擇橫流還是恒壓后面詳細(xì)贅述，整個(gè)轉(zhuǎn)膜過(guò)程，轉(zhuǎn)膜儀需放置在冰水混合物中進(jìn)行。

⑧抗原抗體反應(yīng)

A. 麗春紅染色？？（是否需要麗春紅染色以及什么情況下需要麗春紅染色后面介紹）

B. 剪膜：根據(jù)自己的蛋白位置進(jìn)行剪切

C. 洗膜  5min/3次

D. 封閉  選擇適當(dāng)?shù)姆忾]液進(jìn)行封閉（脫脂奶粉或者牛血清白蛋白）封閉多長(zhǎng)時(shí)間？這個(gè)后面介紹

E. 一抗過(guò)夜孵育F. 洗膜  5min/3次

G. 二抗孵育 室溫一小時(shí)

H. 洗膜  5-10min/3次

⑨ECL發(fā)光成像

   ECL發(fā)光液A液與B液1：1混合，將發(fā)光液滴到膜上曝光觀察，若是對(duì)同一張膜進(jìn)行其他蛋白曝光處理，可用一抗二抗洗脫液洗脫后重新一抗二抗孵育處理，若是對(duì)同一蛋白進(jìn)行重新曝光則不需要。